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来自 皇冠金沙城网站 2019-10-30 19:56 的文章
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苹果树烂掉病病菌分生孢子获取情势切磋,苹水

根皮苷是一种存在于植物组织中的物质,在苹果树组织中含量很高,被认作是苹果树贮存碳水化合物的一种形式。而今天要聊聊 苹果树腐烂病菌发酵液中根皮苷主要降解成分的分析。

摘要采用4种方法对苹果树腐烂病病菌的产孢条件进行了研究。结果表明,采用灭菌苹果枝条和30%ABA培养基能够快速、大量获得苹果树腐烂病病菌分生孢子,持续光照和25℃培养也是病菌产孢的必要条件。

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关键词 苹果 苹果树腐烂病 分生孢子 持续光照

一.实验目的

苹果树腐烂病(Valsa mali Miyabe et Yamada)是我国各主要苹果产区普遍发生且危害严重的一种病害,其病原菌主要侵染苹果树枝干,使被害苹果树树皮腐烂,树枝枯死,发生严重时导致树体死亡,甚至毁园。掌握苹果树腐烂病发病流行规律是制定病害防治措施的基础。研究病害流行规律需借助病原菌人工接菌技术,而苹果树腐烂病病菌在普通PDA培养基上极难产孢,因此我们设计了几种诱导苹果树腐烂病病菌产孢的试验,最终筛选出几种诱导苹果树腐烂病病菌大量、快速产孢的有效方法。现将结果报道如下。

苹果树腐烂病是一种苹果树皮干腐烂病,通常是由于感染苹果黑腐皮壳菌所引起,苹果树腐烂病可以侵染苹果树的多个部位,严重影响了苹果树的健康,从而造成经济上的损失。虽然国内外已经有很多人研究了苹果树腐烂病菌,但是还未有人准确表明到底是何种物质使得苹果树中根皮苷发生降解,因此本文以苹果树腐烂病的病原菌及发酵液中的多种物质作为研究对象,对根皮苷的降解进行实验,进而分析出影响根皮苷降解的物质,从揭示出腐烂病的发病机理为苹果树种植提供理论依据。

1 材料和方法

二.实验方法

1.1供试菌株

1.以根皮苷为碳源培养的病原菌发酵液及其对根皮苷的降解作用

供试菌种为中国农业科学院果树研究所植物保护技术中心真菌病害实验室保存的苹果树腐烂病病菌菌株,分离自辽宁省兴城市中国农业科学院果树研究所国家苹果种质资源圃中发病的苹果枝条,试验前在PDA培养基上活化4~5天。

将根皮苷作为培养病原菌的碳源,并保持培养基中的根皮苷浓度为1g/L。在培养基中加入几块苹果树腐烂病菌菌饼室温培养,培养过程中保持静置,每天定时进行振摇。培养十天左右,用布氏漏斗进行抽滤,得到病菌菌丝,在烘箱中80℃烘干并称取质量。取另一份发酵液,用滤膜过滤,将得到的无菌发酵液稀释十倍,检测根皮苷含量,实验过程中将不接菌培养作为对照物。

1.2供试产孢基质

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常规PDA培养基去皮马铃薯200 g、葡萄糖20 g、琼脂10 g、水1 000 mL,灭菌备用。

2.以淀粉为碳源培养的病原菌发酵液及其对根皮苷的降解作用

30%ABA培养基苹果树树皮300g、琼脂10 g、水1 000 mL,灭菌备用。

发酵液的发酵方法与根皮苷为碳源的方法一致,发酵培养三十天左右,用滤膜过滤,将得到的无菌发酵液稀释至含根皮苷0.1g/L,摇匀静置十天后检测根皮苷含量,检测过程中以0.1g/L根皮苷溶液作为对照物。

灭菌苹果树枝条采集田间2年生健康的苹果树枝条,切成长8 cm的小段,取3-4枝装入250 mL的三角瓶中并加入3~4mL的蒸馏水,湿热灭菌备用。

澳门皇冠金沙网站,3.有机酸、蛋白类物质对根皮苷的降解作用

未灭菌苹果树枝条采集田间2年生健康的苹果树枝条,切成长约30 cm的小段,用无菌水洗净,并用打孑L器间隔6 em在树皮上打孔,然后每孑L滴加7 uL氨水,以获取易于病菌快速定殖的少量死亡组织,晾干后将枝条两端蜡封处理。

首先将以离子交换树脂进行溶胀处理,随后用4%的盐酸浸泡半小时后抽滤,用二次水洗至中性,然后用3%的氢氧化钠溶液浸泡半小时,再进行抽滤并洗至中性。将预处理好的树脂装柱,将无菌发酵液倒入柱子中,使有机酸交换到阴离子交换树脂中,过完柱子后用0.15mol/L的氨水进行脱洗,脱洗后的溶液减压蒸馏出去残留氨水,用盐酸调至pH为3.5,得到有机酸液。在有机酸液中加入硫酸铵,沉淀发酵液中的蛋白类物质,用半透析膜进行透析处理得到粗蛋白液,将粗蛋白液进行冷冻干燥,得到蛋白类物质。发酵剩余液即除去有机酸和蛋白类物质之后的发酵液。将0.1g/L的根皮苷水溶液作为对照标准,分别检测含根皮苷0.1g/L的有机酸溶液、含根皮苷0.1g/L的发酵剩余液以及汉根皮苷0.1g/L、蛋白类物质1g/L的水溶液。再分别配制含根皮苷0.1g/L以及不同浓度蛋白类物质的水溶液,以空白物质作为对比参照物,测定不同浓度蛋白类物质对根皮苷降解的影响。对于根皮苷降解时间的影响则用含根皮苷0.1g/L、蛋白类物质0.1g/L的水溶液,分别在室温下静置降解不同时间。

1.3产孢方法

三.实验结果

将PDA平板培养基上培养7天的病菌打成直径5 mm的菌饼,分别接种于PDA平板培养基和30%ABA培养基上,每个处理3次重复。

1.苹果树腐烂病菌对根皮苷的降解作用

将PDA平板培养基上培养7天的病菌打成直径5 mm的菌饼,接种于灭菌的苹果树枝条上,每瓶接2~3个菌饼,3次重复。

以根皮苷为碳源培养的腐烂病菌中,每100mL发酵液含干质菌丝48毫克,说明苹果树腐烂病菌是以根皮苷作为碳源的。在病原菌发酵后,检测到的根皮苷低于不接菌培养的对照物,并且病原菌对根皮苷的利用率高达90%。

将直径5 mm的菌饼接种在用氨水处理好的苹果树枝条上,用保鲜膜保湿培养。以上几种产孢试验方法均在25℃的温室中进行,并设置黑暗培养、12小时光暗交替培养(12小时光照和12小时黑暗)、24小时持续光照培养3种不同方式。

2.苹果树腐烂病菌发酵液对根皮苷的降解作用

2 结果与分析

通过淀粉培养的无菌发酵液在处理根皮苷后,发酵液中几乎不含根皮苷,说明发酵液中含有特定物质可以彻底降解根皮苷,而且无菌发酵液降解根皮苷的效率为99%以上。

2.1

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光照条件对病菌产孢的影响

3.发酵液中各其他成分对根皮苷的降解作用

通过观察发现,不同光照条件下苹果树腐烂病病菌产孢速率为:持续光照培养>12小时光暗交替培养>黑暗培养;不同光照条件下苹果树腐烂病病菌产孢量大小的差异为:持续光照培养>12小时光暗交替培养>黑暗培养,所以持续光照和25℃培养是苹果树腐烂病病菌产孢的必要条件。

之前分别提取了有机酸、蛋白类物质以及发酵剩余液,并分别进行了根皮苷的降解实验,目的是为了找出发酵液中能够降解根皮苷的物质种类。经过对实验结果的分析,有机酸与发酵剩余液在实验后的溶液中根皮苷含量几乎没有变化,说明这两种物质根皮苷几乎没有降解作用。而蛋白类物质在试验后溶液中根皮苷含量明显降低,其对根皮苷的降解率在90%,说明发酵液中蛋白类物质才是降解根皮苷的主要活性物质,经推测这些蛋白类物质的作用与降解细胞壁酶类相似。而且由实验结果可知,时间越长、蛋白类物质越多,对根皮苷的降解作用越明显。

2.2 PDA培养基和30%ABA培养基产孢情况

四.结论

接种病菌菌饼到PDA培养基后,1周左右菌落长满全皿,但需30天左右才能在菌落表面形成许多凸起的小包,即病菌的分生孢子器,继续培养至第40~45天观察发现已有部分分生孢子器涌出黄色的分生孢子角,常规PDA培养基培养极易操作,但试验周期较长。

本文通过实验证明了根皮苷被苹果树腐烂病菌作为碳源长期利用的原因为:苹果树腐烂病菌在发酵过后,生成了某种特殊物质,从而产生了能够降解根皮苷的能力。随后又通过实验表明,苹果树腐烂病菌发酵过程中所产生的蛋白类物质是降解根皮苷的主要物质。发酵液中存在的有机酸类以及发酵剩余液中其他物质对根皮苷的降解作用非常低,几乎不具有降解根皮苷的能力。至于蛋白类物质中何种物质起了主导作用,目前还无法确定,有待进一步的研究。

接种病菌菌饼到30%ABA培养基后,菌落生长较慢,10天后观察,菌落直径5~6 cm,表面产生大量凸起的分生孢子器并涌出黄色的分生孢子角和分生孢子丝。该培养基产孢时间较快,产孢量较大,制培养基的树皮较易获得,是比较理想的方法。

2.3灭菌苹果树枝条产孢情况

灭菌的苹果树枝条接种菌饼15天后观察,三角瓶中苹果树枝条上开始产生大量的黑色小点即分生孢子器,部分分生孢子器已涌出黄色分生孢子角和分生孢子丝。苹果树枝条易于获得,病菌生长周期短,不易被污染,此方法简单易行,是较为理想的苹果树腐烂病病菌的产孢培养方式。

2.4未灭菌苹果树枝条产孢情况

未灭菌的苹果树枝条接种菌饼15天后观察,苹果树腐烂病扩展的部位已有分生孢子器产生,部分枝条表面已涌出分生孢子角和分生孢子丝,但有些枝条已被青霉菌或其他杂菌污染,无法再继续形成分生孢子器。该方法操作比较复杂,而且由于密封性不佳和湿度较大,极易产生杂菌污染苹果树枝条,故不是一种理想的苹果树腐烂病病菌室内产孢方法。

3 小结

进行苹果树腐烂病研究,需要有一种能够迅速、大量产生分生孢子的试验方法。获取病菌孢子最简单的方法是在早春降雨或空气潮湿时,到田间苹果树腐烂病病皮上找病菌金黄色的分生孢子角,或找到带小黑点的病皮和成熟尚未裂口的分生孢子器带回室内用温水淋湿,约1小时后,分生孢子器内可涌出病菌的分生孢子角。在苹果树腐烂病病菌的研究过程中,经常由于环境和季节因素不易直接获得分生孢子。本研究发现,常用的PDA培养基不能满足此项要求,而采用30%ABA培养基和灭菌苹果树枝条获得了短时间内大量产孢的效果,可作为苹果树腐烂病病菌产孢的首选方法。

不同的苹果树腐烂病病菌株系产生分生孢子器方式有所差异,有些病菌分生孢子器在培养皿表面无序散生,有些在培养皿中央集中生长,而且不同株系产孢量有较大差异,这可能是由于苹果树腐烂病病菌不同的致病专化型所致。在病菌的培养后期,分生孢子器可产生金黄色卷曲的分生孢子丝,但这需要较长的时间。通常情况下,观察到培养皿或枝条上有大量的小黑点即病菌的分生孢子器时,可将培养皿或枝条上的小黑点用刀片刮至研钵中,研碎分生孢子器并添加适量的无菌水,用纱布过滤,然后根据试验需要调整分生孢子的浓度。

ABA培养基加速苹果树腐烂病病菌产孢的时间和产孢量,可能是由于改变了培养基成分,加速病菌由营养生长向生殖生长过渡的时间。我们通过试验发现,在用生防菌菌株处理苹果树腐烂病病菌的过程中,在抑菌圈附近极易产生大量的分生孢子器,这也是由于病菌营养生长被抑制的结果,可作为加速苹果树腐烂病病菌产孢的新方法。

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